برای این که فاکتورهای که باعث افت میزان هیدرولیز می شوند مشخص شوند، سه مرحله هیدرولیز مجدد مشابه صورت گرفت تا نتایج کاملاً مشخص گردد به دلایل اثرات عدم تأثیر سلولاز و یا تغییرات ساختاری سلولز در خلال فرآیند هیدرولیز . پس از اولین فرآیند هیدرولیز طی 6 روز مواد هیدرولیز شده سانترفیوژ شدند ، و سه بار با آب مقطر شسته شدند و سلولاز تازه خام به حجم اصلی در ابتدا کار اضافه شد . وزن خشک پنبه باقی مانده بصورت موازی آزمایش شد . پس از این مرحله ، هیدرولیز دائم تحت همان شرایط 6 روز بعد ادامه یافت . آزمایش هیدرولیز مجدد برای بار سوم تکرار شد . بقایای سلولز هر مرحله به عنوان ماده اولیه جهت تعیین تغییرات ساختاری و آزمایش ظرفیت جذب سلولاز استفاده شدند [9].

 

 

2-3- تغییرات ظرفیت جذب سلولاز پس از هیدرولیز مجدد

در یک آزمایش اولیه ، سلولاز خام مخلوط شد با لیف پنبه ای به حالت معلق و در یک آزمایش تعادلی با 01/0 IUCBH ، 10/0 IU EGS و 005/0 در هر میلی گرم پنبه صورت گرفت . مخلوط در Mm20 استات سدیم در 8/4=PH به مدت 90 دقیقه و در 4 درجه تهیه شد و تعادل کامل بدست آمد و سپس عمل سانتریفیوژ انجام گرفت و پس از 10 دقیقه فعالیت سلولاز آزاد در فاز مایع تعیین گردید . آنزیم های جذب شده از روی اختلاف بین فعالیت های آنزیم اولیه و مواد بدون آنزیم در فاز مایع که با سلولز پیوند یافته بود برآورده شد .

آزمایش جذب در یک غلظت معین سلولازولیف پنبه، حداقل 5 نوبت تکرار شد تا نتایج ثابتی به دست آید .

پس از 6 روز هیدرولیز ، باقی مانده سانتریفوژ شد و محصول حاصله با Mm20 در لیتر با فراستات سدیم شسته شد و بعداً بعنوان ماده اولیه مورد استفاده قرار گرفت .

ماده مذکور در همان محلول بافر قرار داده شد تا جذب صورت گیرد .

در تمامی آزمایشات ، درصد سلولاز جذب شده تعیین گردید . برای جدا کردن اثر سلولاز جذب شده روی الیاف باقی مانده ، از لحاظ ظرفیت جذب مجدد ، یک آزمایش جذب بصورت آزمایش کنترل انجام شد . الیاف پنبه ای باقی مانده تریتون و گلیسرون در بافر استات سدیم (8/4 =PH) در دمای 40درجه سانتی گراد برای 10 دقیقه شسته شدند تا سلولاز جذب شده کاملاً شسته شود . الیاف پنبه ای جذب نشده دوباره به حالت معلق در محلول بافر قرار داده شود ،و محلول مذکور دارای سلولاز خام تازه بوده که برای تمامی آزمایشات جذب فوق مورد استفاده قرار گرفت  [10].

2-4- تغییرات خواص  ساختاری الیاف پنبه ای از راه آنالیز دستگاهی SEM و AFM و X-rag و FT-IR در خلال هیدرولیز توسط آنزیم

تعیین تغییرات فراساختاری توسط دستگاه SEM و AFM :

پس از هیدرولیز در 45 درجه سانتی گراد تا مدت زمان مناسب ، الیاف پنبه ای روی یک فیلتر شیشه ای قرار داده و شسته شدند و سپس در دمای 40 درجه و خلإ خشک شدند .

یک نمونه کنترلی با استفاده از همان روش جایگزین کردن محلول سلولاز با بافر تحت عمل قرار گرفت برای آزمایشات SEM ، الیاف کار شده با طلا روکش شدند و با میکروسکوپ الکترونی مورد مطالعه قرار گرفتند .

برای آزمایشات AFM ، از یک دستگاه AFM استفاده شد که دارای یک اسکنر  10 با کانتی لورسیلیکون  استفاده شده.

آزمایشات با میزان اسکن کردن در حدود 5/0 تا 1 هرتز انجام شد و فرکانس از 250 تا 350 هرتز و شدت های آن از 10 تا 100 میلی ولت بود [12].